冷鲜鸡肉中金黄色葡萄球菌平板计数不确定度评估

冷鲜鸡肉中金黄色葡萄球菌平板计数不确定度评估 李晓娟 摘要：为量化金黄色葡萄球菌平板计数法的测量不确定度并明确误差因素影响，本研究以冷鲜鸡肉为基质，依 GB 4789.10-2016 标准实验，系统分析技术操作与基质干扰两类核心不确定度来源。经重复实验量化稀释、涂布、计数操作误差，无菌基质加标回收解析基质干扰机制，结合统计分布理论判断分量分布类型，以方和根法算合成不确定度，取包含因子 k=2 确定扩展不确定度。结果表明，涂布均匀性（相对标准不确定度 0.027）与基质干扰（相对标准不确定度 0.039）为主要误差来源，二者占合成相对标准不确定度（0.039）的 70% 以上；实际样品扩展不确定度 0.4×10³CFU/g，结果表达为 (5.2±0.4)×10³CFU/g（k=2）。本研究建立的评估框架可为食品微生物检测实验室质控提供技术支撑，亦为同类微生物计数方法不确定度评定提供参考。 Abstract：To quantify the measurement uncertainty of the plate count method for Staphylococcus aureus and clarify the influence of error factors, this study conducted experiments using chilled chicken as the matrix in accordance with GB 4789.10-2016, systematically analyzing two core sources of uncertainty: operational errors and matrix interference. The study quantified the operational errors in dilution, spreading, and counting through repeated experiments, analyzed the matrix interference mechanism via sterile matrix spiked recovery tests, determined the distribution types of each uncertainty component based on statistical distribution theory, calculated the combined uncertainty using the root-sum-of-squares method, and confirmed the expanded uncertainty with a coverage factor k=2. The results showed that spreading uniformity (relative standard uncertainty: 0.027) and matrix interference (relative standard uncertainty: 0.039) were the main error sources, and these two factors accounted for more than 70% of the combined relative standard uncertainty (0.039). The expanded uncertainty of actual samples was 0.4×10³ CFU/g, and the result was expressed as (5.2±0.4)×10³ CFU/g (k=2). The evaluation framework established in this study can provide technical support for quality control in food microbiology testing laboratories and reference for uncertainty assessment of similar microbial counting methods. 关键词：金黄色葡萄球菌；平板计数法；不确定度评估；基质干扰；操作误差 Keywords：Staphylococcus aureus; plate count method; uncertainty assessment; matrix interference; operational error 引言 金黄色葡萄球菌是常见食源性致病菌，其在食品中的污染水平是食品安全风险评估的核心指标，平板计数法作为GB 4789.10-2016规定的经典方法，因操作简便被广泛用于日常检测。但实际检测中，稀释精度、涂布均匀性、菌落识别差异等技术环节的波动，以及食品基质中成分与共生微生物的干扰，均会导致计数结果产生偏差，而缺乏对这种偏差的量化评估会降低数据可信度。目前行业内相关研究多侧重单一误差环节，缺乏结合实际食品基质的综合分析。基于此，本研究以冷鲜鸡肉为基质，系统识别平板计数法的不确定度来源，量化各分量大小并完成合成与扩展不确定度计算，建立贴合实践的评估流程，为提升微生物计数结果科学性提供支撑。 1材料与方法 1.1材料与试剂 实验选取的标准菌株为金黄色葡萄球菌ATCC6538，该菌株购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，使用前需经胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）活化培养24h以确保菌株活性达到实验要求。培养基选用胰酪大豆胨琼脂培养基（PCA）与胰酪大豆胨液体培养基（TSB），两者均采购于北京陆桥技术股份有限公司，批号分别为20240105与20240112，使用前通过梅特勒-托利多pH计测定PCA培养基pH值为7.3±0.2，完全符合GB 4789.28-2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》中的规定[1]。稀释液为0.85%无菌生理盐水，由实验室自行配制后经121℃、15min高压蒸汽灭菌处理，灭菌后的稀释液需通过无菌培养验证确认无微生物污染方可投入使用，这些材料与试剂的前期筛选和验证工作，为实验准确性奠定了基础。 1.2仪器与设备 实验配备的仪器与设备均完成年度校准且校准证书处于有效期内，其中恒温培养箱为上海一恒科学仪器有限公司生产的DHP-9052型，控温精度可达±0.5℃，最近一次校准日期为2024年3月10日；超净工作台选用苏州净化设备有限公司的SW-CJ-2FD型双人单面垂直送风设备，洁净度等级达到100级，风速稳定在0.38-0.52m/s之间；电子天平为梅特勒-托利多PL2002型，精度0.01g，最大称量2000g，校准证书编号为JJG20240315；压力蒸汽灭菌器则是上海申安医疗器械厂的LDZX-50KBS型立式设备，灭菌温度误差控制在±1℃，压力控制精度为0.01MPa。辅助器具包括1mL单标线移液管（A级，容量允差±0.005mL）、直径90mm无菌培养皿等[2]，所有器具均经灭菌处理后才用于实验操作，仪器设备的精准性为实验数据可靠提供了保障。 1.3实验方法 实验以市售冷鲜鸡肉作为基质样品，样品处理与前期稀释、涂布操作严格遵循GB 4789.10-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》，且为评估方法的再现性与重复性，分别采用图1再现性条件设计与图2重复性条件设计开展实验。 对于再现性条件（如图1所示），实验室样品经制备为测试样品后均质，分为两个测试部分；其中一个测试部分制备初始混悬液时，根据需求进行人工染菌操作，另一个测试部分直接制备初始混悬液，随后对两个测试部分分别开展分析，最终得到结果A（含人工染菌干预）与结果B（无人工染菌干预），以此对比不同条件（如是否人工染菌、操作人员或设备差异等）下方法的表现。 图1再现性条件设计 对于重复性条件（如图2所示），实验室样品制备为测试样品后均质，分为多个测试部分（本实验设置6个测试部分，虚线部分为扩展示意），每个测试部分均制备初始混悬液并开展分析，最终获取多组平行结果，以此评估相同条件（同一操作人员、同一设备、短时间内等）下方法的稳定程度。 图2重复性条件设计 实际操作中，每个样品在再现性条件下重复测定3组（A、B各3次），重复性条件下则连续测定6次；同时取0.1mL无菌生理盐水涂布平板作为空白对照，确认无菌落生长后再对符合计数要求的平板进行菌落计数。 2结果与分析 2.1技术不确定度的评估 技术不确定度的本质是实验操作中“人-机-环境”要素的变异对结果的影响，需从微观机理与统计量化两方面深入分析。移液操作的误差由移液管的容量特性与操作人员的手法波动共同导致。1mL单标线移液管（A级）的容量允差为±0.005mL（系统误差），而重复10次移液（以20℃去离子水为介质，密度(ρ=0.9982）的质量测量数据，反映了吸液高度、放液速度等随机因素的影响，结果如表1所示。 表1稀释操作移液体积的重复测量数据 重复次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 质量（g） 0.995 0.997 0.996 0.994 0.998 0.996 0.995 0.997 0.996 0.995 体积（mL） 0.997 0.999 0.998 0.996 1.000 0.998 0.997 0.999 0.998 0.997 由表1计算得体积标准偏差为0.003mL，相对标准不确定度为0.003/1=0.003。从流体力学角度看，移液时液体在移液管内的表面张力、黏度会随操作手法微小变化，使得实际移取体积波动，这是随机误差的核心来源。 涂布操作中，0.1mL稀释液在PCA平板表面的扩散均匀性直接决定菌落的空间分布。选取10⁻³稀释度（菌落数处于30-300CFU的最佳计数区间，可最大程度降低计数主观误差）开展3组平行实验，菌落数数据如表2所示。 表2涂布操作的平行平板菌落计数数据 平行样编号 1 2 3 平均值 标准差 菌落数（CFU） 42 45 48 45 2.1 根据统计学原理，菌落计数的标准不确定度需考虑平行样数量的影响，计算公式为u=sxn（s为标准差，x为平均值，n为平行样数），代入得相对标准不确定度为0.027。从微生物生长角度分析，涂布不均会导致局部营养或氧气供应差异，使菌落大小、数量出现波动，进而放大计数误差。 计数误差源于实验人员对“金黄色葡萄球菌典型菌落（金黄色、圆形隆起、边缘整齐）”的形态识别差异。选取3名经标准化培训的人员，对同一组6个平板（涵盖不同菌落密度、形态）独立计数，结果如表3所示。 表3不同人员的菌落计数结果对比 平板编号 人员A（CFU） 人员B（CFU） 人员C（CFU） 平均值 相对标准偏差 1 43 45 44 44 — 2 56 58 57 57 — 3 32 33 31 32 — 4 68 69 70 69 — 5 29 30 28 29 — 6 49 50 48 49 — 总计 — — — — 1.8% 人员计数结果的相对标准偏差为1.8%，即相对标准不确定度0.018。该数值低于行业常见的“人员计数变异系数≤5%”，说明前期的“菌落形态标准图谱培训+实操考核”有效提升了判断一致性。 2.2基质不确定度的评估 冷鲜鸡肉中的脂肪会在PCA培养基表面形成油膜，阻碍菌体与氧气、营养物质的接触，抑制菌落生长；蛋白质经均质后释放的多肽、氨基酸虽能为菌体提供营养，但部分小分子代谢物（如支链氨基酸分解产物）会对金黄色葡萄球菌产生弱抑制作用；此外，样品中原本存在的共生微生物（如乳酸菌、肠杆菌）会与目标菌竞争营养物质，甚至分泌抗菌物质，进一步影响目标菌的可计数性。 通过“无菌基质加标回收+实际样品对比”量化干扰：无菌基质经60Coγ射线辐照灭菌（吸收剂量10kGy，依据《GB 18280辐照食品卫生标准》，确保基质成分不变性且微生物完全灭活），向其中添加浓度为1.02×103CFU/mL的标准菌液（模拟实际样品“中等污染水平”），同时对未加标的实际冷鲜鸡肉样品计数[3]，结果如表4所示。 表4基质加标回收与实际样品的对比数据 实验类型 加标浓度（CFU/mL） 平行样数 平均回收率 回收率标准差 实际样品与加标回收相对偏差 无菌基质加标 1.02×103 5 98.2% 2.3% — 实际样品测定 — 5 — — 3.1% 基质不确定度由“加标回收的随机误差”与“实际样品的系统偏差”方差合成，计算公式为 u基质=(s回收/R)2+(∆/R)2(s回收为回收率标准差，R为平均回收率，∆为相对偏差），代入得0.039，印证了食品基质成分是不可忽视的不确定度来源[4]。 2.3分布不确定度的评估 分布不确定度的关键是为各不确定度分量匹配合理的概率分布，依据误差产生机制与统计学理论，各分量的分布类型、包含因子及标准不确定度汇总于表5。 表5分布不确定度各分量的参数汇总 不确定度来源 概率分布类型 包含因子k 标准不确定度 稀释操作误差 正态分布 1 0.003 涂布操作误差 正态分布 1 0.027 计数误差 近似正态分布（泊松分布N>10) 1 0.149（N=45） 基质不确定度 均匀分布 3 0.022 2.4合成不确定度的评估 通过记录“同一实验序列中，稀释操作的移液体积、涂布的菌落数、计数结果、基质加标回收率”的同步数据，计算两两之间的Pearson相关系数，结果如表6所示，均小于0.1，说明各分量无显著线性关联，满足独立合成前提。 表6各不确定度分量的相关性分析 量组合 稀释与涂布 稀释与计数 稀释与基质 涂布与计数 涂布与基质 计数与基质 相关系数 0.08 0.05 0.03 0.07 0.09 0.06 将各分量的相对标准不确定度（稀释：0.003；涂布：0.027；计数：0.018；基质：0.022）代入方差合成公式：uc=u稀释2+u涂布2+u计数2+u基质2。计算得合成相对标准不确定度0.039。结合实际样品平均计数结果5.2×103CFU/g，合成标准不确定度为：Uc=5.2×103×0.039≈202.8CFU/g。该值反映了所有误差因素综合作用下，计数结果的分散程度。 2.5扩展不确定度的评估 扩展不确定度用于给出“包含真实值的可信区间”，需结合有效自由度与包含因子确定，关键参数汇总于表7。 表7扩展不确定度计算参数 参数类型 参数值 说明 合成标准不确定度 ≈202.8CFU/g 由方差合成计算得到 有效自由度veff ≈18 韦尔奇-萨特思韦特公式计算 t分布因子t0.95，18 2.101 置信概率95% 包含因子k 2（简化取值） 实验室检测领域常用保守值 扩展不确定度U ≈405.6.CFU/g U = k × Uc 最终结果表达 (5.2±0.4)×103CFU/g(k =2) 修约后结果 这样既明确了测量结果的最佳估计值，又界定了95%置信水平下真实值的可能范围，对食品安全风险评估而言更具参考价值。 3结语 通过本次金黄色葡萄球菌平板计数法不确定度的系统评估，我们清晰梳理了实验全流程中各类误差因素的来源与影响权重，其中涂布操作的均匀性控制与基质成分的干扰效应是驱动不确定度水平的核心要素，这两项因素引入的相对标准不确定度占合成不确定度的比例超过70%，这一发现直接指向了微生物计数实验中“操作规范性”与“基质适配性”两大关键控制点。 从实验室实际工作视角来看，本次评估结果为日常质量控制提供了精准的改进方向：规范实验人员的涂布操作手法（如引入螺旋涂布仪替代手工涂布以减少人为波动）、增加基质加标实验的平行样数量（由5个增至8个以降低回收数据的随机误差），这些具体措施均能针对性降低关键环节的不确定度，使得计数结果的重复性与准确性得到实质性提升。同时，评估过程中建立的“技术误差量化-基质干扰分析-分布类型判断-合成与扩展计算”的完整逻辑链，为同类微生物（如沙门氏菌、大肠菌群）平板计数法的不确定度评估提供了可直接借鉴的实操框架，有助于推动食品微生物检测领域不确定度评估的标准化与规范化。 该评估结果的实践价值还体现在食品安全监管与风险评估中，其明确的扩展不确定度表达为检测数据的解读提供了科学边界，让监管部门在判断样品污染程度时能充分考量结果的可信区间，避免因数据解读偏差导致的监管误判。所以说，不确定度评估绝非单纯的理论计算，而是深度关联检测实践、切实提升数据可靠性的核心手段，它不仅能帮助实验室满足ISO17025实验室认可对“结果不确定度评定”的硬性要求，更能为食品安全风险防控提供兼具精度与可信度的数据支撑，最终实现检测数据从“数值呈现”到“科学溯源”的质量跨越。 参考文献 [1]食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验:GB 4789.10—2016[S].北京:中国标准出版社,2016. [2]KURSHEVA A M, YANENKO U M, KOSYANCHUK N I. Verification the detection method Staphylocoscus aureus from food products. Scientific Messenger of LNU of Veterinary Medicine and Biotechnologies[J]. Series: Food Technologies, 26(101): 194-198.. [3]检测和校准实验室能力的通用要求:GB /T27025—2019[S].北京:中国标准出版社,2019. [4]检验检测机构资质认定评审准则:RB/T214—2023[S].中国国家认证认可监督管理委员会,2023.