食品安全国家标准GB4789.10-2016中金黄色葡萄球菌检验方法的探讨

王娟娟 摘要：金黄色葡萄球菌作为耐盐且易产耐热肠毒素的革兰阳性球菌，在乳制品、熟肉制品与即食食品中常被检出，毒素残留与细胞存活构成“双重风险”，所以说检测策略必须既覆盖“有无判断”，也覆盖“数量评估”；围绕这一需求，GB4789.10-2016将流程压实为增菌、分离、甄别与确证，并把方法拆分为定性检验、平板计数与MPN三条路径，使得实验室可以据样品污染水平与工作场景自由切换。本文在交代生物学依据的基础上，梳理三种法定方法的关键节点与计算规则，随后从灵敏度、准确性、检验周期与操作负荷四个维度进行对照，最后把方法选择落到监管抽检与企业质量控制的可执行方案上，体现出“定性快筛—定量确认—风险处置”的闭环思路。 Abstract: Staphylococcus aureus, a salt-tolerant Gram-positive coccus that readily produces heat-stable enterotoxins, is frequently detected in dairy products, cooked meat products, and ready-to-eat foods. The coexistence of toxin residues and viable cells constitutes a “dual risk,” which means testing strategies must address both presence/absence and quantitative assessment. To meet this need, GB 4789.10-2016 streamlines the workflow into enrichment, selective isolation, screening, and confirmation, and divides the methodology into three pathways—qualitative testing, plate count, and MPN—so laboratories can switch according to contamination level and operational context. Building on the biological rationale, this paper summarizes the key steps and calculation rules of the three statutory methods, compares them in terms of sensitivity, accuracy, turnaround time, and operational burden, and finally translates method selection into actionable schemes for regulatory sampling and in-plant quality control, shaping a closed-loop approach of “rapid qualitative screening—quantitative confirmation—risk response.” 关键词：食品安全；金黄色葡萄球菌；GB4789.10-2016；定性检验；平板计数；MPN；风险评估 Keywords: food safety; Staphylococcus aureus; GB 4789.10-2016; qualitative testing; plate count; MPN; risk assessment 引言 金黄色葡萄球菌耐盐、易在高蛋白基质中定植，且可产生耐热肠毒素，风险呈“细胞+毒素”双通道，比方乳制品与熟肉制品一旦被污染，就既可能带菌也可能遗留毒素，使得检验既要回答“有没有”，也要给出“有多少”。GB4789.10-2016以选择性增菌与形态—生化确证为主线，把检测路径划分为定性检验、平板计数与MPN三种方案，便于实验室按污染水平与业务目标灵活切换[1]，所以说本文按“原理—方法—比较—应用”的顺序阐述依据与操作，并把选择策略落到监管与企业的实际流程中。 1.检验原理 1.1生物学特性与检验依据 金黄色葡萄球菌是常见的革兰阳性球菌，耐盐、能在富含蛋白质和脂类的食品中存活，并可产生耐热肠毒素，引发急性呕吐和腹泻等食物中毒。这种“双重风险”使得检测既要关注细胞是否存在，也要在必要时结合毒素检验。该菌在含卵黄和亚碲酸盐的选择性培养基上可表现出黑色光亮菌落伴沉淀环和透明圈，在血琼脂上则常见溶血现象，结合触酶和血浆凝固酶试验，就能与凝固酶阴性葡萄球菌区分开来，这些特征共同构成了国标检验方法的基础。 1.2定性与定量的逻辑关系 GB4789.10-2016将检验思路拆解为增菌、分离、甄别与确证几个环节，并根据检测目的设定三种方法：定性检验用于判定样品是否被污染；平板计数适合高水平污染样品的数量评估；MPN法则用于低水平污染的统计估算。定性结果回答“有没有”，定量数据说明“有多少”，两者在食品安全监管和企业质量控制中相互衔接，使风险评估、合格判定和工艺调整都有据可依[2]。 2.检验方法 2.1定性检验方法 定性流程就是把目标菌“托举出来再确认身份”：取25g固体或25mL液体样，与7.5%氯化钠肉汤均质成匀液并在约36℃培养18–24h进行预增菌，使得耐盐且适应性强的菌株获得优势，随后把培养液分别划线到Baird–Parker（BP）选择性琼脂与血琼脂，前者观察24–48h的典型性状，后者观察18–24h的溶血与菌落外观，这样把“富集—分离—初筛”串成一体，所以说很契合监管抽检的“快筛+确证”节奏[3]。典型菌落在BP上常呈灰黑至黑色、具光泽并伴沉淀环与外侧清晰带，在血平板上多见较大而湿润的金黄色或偏白菌落，这些“形态学指纹”与革兰阳性镜检结果叠加，就把候选范围有效收敛到致病性葡萄球菌。 图1金黄色葡萄球菌检验程序。 确证环节强调“多指征并举”，就是从可疑菌落中选取若干个体完成染色镜检、触酶与血浆凝固酶试验，凝固酶阳性作为关键证据配合阳/阴性对照使用；结果存疑时可在BHI复壮后重复，遇疑似食物中毒再辅以肠毒素检测，把“检出目标菌”与“症状学表现”连成证据链，报告以“在25g（mL）样品中检出/未检出”表达，便于快速处置。操作上，BP平板需避免表面水珠并适度干燥以防拖影；冷冻或脱水样品常见“黑度浅、质地干”的非典型外观，确认数量放宽到至少5个更稳妥，这样与血平板溶血圈及凝固酶结果互证，有助于把结论压实，也体现出“形态—生化—对照”的三重校验思路。 2.2平板计数法 当样品的污染水平预计偏高时，平板计数就成了量化负荷的直接工具，检验员先以磷酸盐缓冲液或生理盐水制备1∶10的样品匀液，再做10倍系列递增稀释，并在每一步更换吸管或吸头来避免回流污染，这样的稀释链有助于把实际菌落落点“落”进可计数区间；在接种阶段，常以1mL总接种量分摊到三块BP平板，惯用的分配是0.3/0.3/0.4mL，用无菌涂布棒均匀涂布至全板，若平板表面出现水珠便先行干燥，等到表面无水后再涂布，培养结束后基于BP的典型性状挑取可疑落点去做确证[4]。 图2金黄色葡萄球菌平板计数法检验程序。 计数阶段并不直接把“看见的典型落点”当作金黄色葡萄球菌数，而是先在同一稀释度三块平板的合计菌落数处于20–200CFU的范围内进行计数，再从中至少挑取5个可疑落点做确证，随后用“确证阳性/送检数”的比例去修正该稀释度的典型菌落总数，这样一来，结果就把“形态筛选误差”折算进统计框架；当不同稀释度出现“仅一个稀释度落入可计数范围”“低稀释度小于20CFU”“某稀释度大于200CFU而下一稀释度无菌落”等边界情形时，标准给出了分支计算的取值规则[5]，最后通过式(1)与式(2)把单稀释或双稀释的结果换算为样品中的CFU/g（mL），报告端再按该值输出。 （式(1)） 式(1)中:样品中金黄色葡萄球菌菌落数;某一稀释度典型菌落的总数;某一稀释度鉴定为阳性的菌落数;某一稀释度用于鉴定试验的菌落数;稀释因子。 （式(2)） 式(2)中:样品中金黄色葡萄球菌菌落数;第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数;第一稀释度(低稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;第一稀释度(低稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数;第二稀释度(高稀释倍数)鉴定为阳性的菌落数;第二稀释度(高稀释倍数)用于鉴定试验的菌落数;稀释因子(第一稀释度)。 从方法学理解上看，0.3/0.3/0.4mL的分配就是把“1mL总量+三板独立重复”的可靠性兼顾到位，既避免一次性大体积导致涂布不匀，也给计数区间提供了三次落点机会；20–200CFU的窗口是“既能清晰分辨个体又不至于重叠”的经验带，落在这个窗内的分子噪声相对可控，所以说，日常工作中更像是用“预估污染度—选稀释度—看区间—算比例—出结果”这一闭环去完成计数任务，匀度、涂布、干燥、挑取、确证这几个小节点把控得越细，平板计数的重现性与跨批次可比性就越好。 2.3金黄色葡萄球菌MPN计数 当样品的污染预计较低、菌体分散不均或者背景菌抑制强烈时，MPN的思路就显得更合适一些，检验员会基于预判挑选三个相邻稀释度，每个稀释度接种三管7.5%氯化钠肉汤并在36℃培养18–24h，接着从各阳性管取材划线至BP平板以获取典型落点，再以染色镜检与凝固酶试验进行确证，一旦确证阳性，就把每个稀释度的“阳性管数组合”带入附录中的检索表，读出每克（每毫升）样品的最可能数；整套流程见图3，报告端使用MPN/g（mL）表达。 图3金黄色葡萄球菌MPN法检验程序。 与平板计数相比，MPN把“不易落入可计数区间”的问题转化为“阳性管概率”的统计估计，所以说它对低水平污染的检出更友好，不过三管并行×三稀释度的设计自然拉长了培养与确认的总时长，组织安排上更像“预判—接种—读管—平板确认—查表—报告”的节拍；在真实工作中，背景菌多且抑制力强的样品（比方调味酱或复合调味品）做平板计数经常失手，MPN通过先在耐盐肉汤里把目标菌“养出来”再去BP上确认，反倒提高了“有量可报”的概率，这一特性对合格判定与工艺整改很有帮助。 3.方法比较与评价 3.1灵敏度与准确性比较 定性检验靠增菌“托举”低水平污染，更容易给出有无判断，所以说适合批量快筛但不给数量；平板计数就是直接计数再用“典型菌落数×确证阳性比例”修正，使得数值更稳、更便于在高污染样品中做横向比较与趋势分析；MPN 法依据阳性管组合推算最可能数，对低负荷更敏感，那么结果属于概率估算，准确度受统计表与样品代表性影响。基于这些差异点，表1对三种方法的灵敏度、准确性与结果类型做了并列对照，便于后续选择与应用。 表1三种方法在灵敏度与准确性上的要点对比 方法 检出思路 对低污染的把握 结果类型 准确性控制点 定性检验 选择性增菌后分离+形态/生化确证 较强（增菌先行） 检出/未检出 典型菌落判读+触酶/凝固酶确证 平板计数法 落入20–200CFU区间计数并按确证比例修正 中等（高负荷最稳） CFU/g或CFU/mL 区间控制+式(1)/(2)换算 MPN法 三稀释×三管阳性概率估计+平板确证 强（低负荷更友好） MPN/g或MPN/mL 阳性组合查表+确证阳性一致性 3.2检验周期与操作复杂度对比 定性检验就是“增菌+一次平板”，整体约 2–3 天，流程最简，难点在典型性状判读与凝固酶确证；平板计数的时程接近，却要叠加系列稀释、三板接种与比例修正和计算，步骤更密集、对规范操作更挑剔；MPN 在前期增菌外还要读管与查表，通常最耗时，多稀释×多管组合对读数一致性要求高，所以说培训与复核必须跟上。可对照表2快速选择路径。 表2三种方法在检验周期与操作负荷上的对照 方法 主要培养时程构成 关键人工环节 操作负荷（相对） 典型输出 定性检验 7.5%NaCl肉汤18–24h+BP24–48h 典型菌落判读与凝固酶确证 低—中 检出/未检出 平板计数法 BP24–48h（前置稀释与涂布） 稀释链与三板接种、区间判读、比例修正与计算 中—高 CFU/g（mL） MPN法 肉汤18–24h+BP24–48h（读管与查表） 三稀释×三管读管、转接确认、MPN表检索与记录 高 MPN/g（mL） 4.方法应用 4.1在食品安全监管中的应用价值 在国家食品安全监管体系中，金黄色葡萄球菌作为法定监测指标，其检验结果不仅决定样品批次的合格与否，还直接关系到市场准入、风险预警和行政执法。定性检验在这一体系中具有不可替代的作用，因为监管抽检往往覆盖大批量样品，需要在有限时间内快速筛查潜在问题批次。比如在乳制品、熟肉制品或糕点等高风险品类的监督抽检中，检验人员使用定性方法对每25g或25mL样品做“检出/未检出”判断，一旦发现阳性，即可启动不合格通报程序，并暂停该批次产品的销售。 在后续溯源和风险评估环节，平板计数法和MPN法则发挥补充作用。平板计数结果能够为监管部门提供明确的数量级数据，例如某批次熟肉制品检出1.2×10³CFU/g时，监管人员不仅可以据此判定该批次不合格，还能把数值与以往抽检数据对比，研判企业生产环节的波动趋势。而在低水平污染但仍可能带来食品中毒风险的案件中，MPN法则显示出其优势，能够通过概率推算检出微量污染，为调查提供关键线索。这种“定性筛查—定量确认—综合判定”的模式，体现出国标方法在食品安全监管中的层层递进逻辑，使得抽检不仅停留在是否合格的判定上，还延伸到风险分级、趋势分析与政策制定。 4.2在食品企业质量控制中的应用实践 在食品生产企业的质量管理体系中，金黄色葡萄球菌检验既是合规要求，也是生产过程稳定性的“健康指标”。企业内部检测通常更注重过程监控和趋势分析，而不仅仅是出厂产品的合格判定。平板计数法在这一场景中使用最为普遍，因为它能提供直观、可量化的菌落形成单位数据。比方说，企业在成品检验之外，还会定期对环境样品进行检测，包括空气沉降菌、工作台拭子、工器具表面和员工手部样品。若监测数据持续保持在一个较低水平，说明清洁消毒措施有效，操作人员卫生习惯良好；若出现数值异常升高，就能提示生产环节可能存在交叉污染或消毒不到位，从而及时启动纠偏措施。 在一些高风险或出口产品生产中，企业还会结合MPN法，以确保即便是低水平污染也能被检出。例如婴幼儿配方乳粉的生产中，出厂检验若仅依赖平板计数法，可能在极低菌落水平下出现“未检出”的结果，而采用MPN法则能进一步降低漏检风险，这对于企业履行国际贸易中的食品安全承诺尤为重要。同时，在HACCP管理体系中，金黄色葡萄球菌作为关键控制点的监测指标，往往需要与生产批次记录、清洁消毒记录结合分析，企业可通过长期数据积累形成风险曲线，为工艺优化和质量改进提供科学依据。 所以国标方法在企业端不仅是“被动满足监管”的要求，更是“主动提升质量”的工具。通过合理选择定性检验、平板计数和MPN法，企业可以构建多层次的质量监控体系，把潜在的食品安全问题消灭在生产线内，而不是等到产品流入市场后才被抽检发现，这种前移式的应用实践为企业降低风险和树立品牌信誉提供了坚实支撑。 总结 围绕不同污染水平与场景，定性检验用来快速亮起风险信号，平板计数在可计数区间提供稳定CFU数，MPN以阳性组合估算低负荷水平，那么实验室就可以按“定性快筛—定量跟进—风险处置”的节拍组织工作；监管侧据此完成批次判定与趋势复盘，企业侧据此完成过程监控与放行决策，有助于把问题消灭在生产端。后续把免疫磁珠富集、qPCR或LAMP作为前置筛查，再由国标路径确证与报告，体现出更高的效率与可追溯性。 参考文献 [1]潘抒凡,杨栋磊,王鹏飞.基于纳米孔Cas9靶向测序的金黄色葡萄球菌快速检测与分型[J].上海交通大学学报(医学版),2025,45(06):774-783. [2]王琪,刘琳,李易泽.凉菜中三种常见致病菌多重荧光PCR快速检测方法的建立及应用[J].中国食品工业,2025,(12):95-97. [3]杨书博.金黄色葡萄球菌噬菌体脂质体构建及杀菌效果研究[D].黑龙江八一农垦大学,2025. [4]商迎辉,李乾伟,黄汉昌,等.金黄色葡萄球菌模板制备的比较研究[J].北京联合大学学报,2025,39(03):45-52. [5]何媛,杨杰,海妮·巴音达,等.干制水果中金黄色葡萄球菌3种鉴定方法的比较[J].食品安全质量检测学报,2025,16(10):272-277.